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轉錄組學

真核轉錄組測序

　　轉錄組即特定細胞在某一功能狀態下轉錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。通常指某一狀態下的所有mRNA轉錄本。

技術優勢

高覆蓋度：單次轉錄組測序實驗即可獲取全面的編碼RNA信息。
鏈特異性文庫：採用dUTP鏈特異性文庫構建方案，確保轉錄本的方向性，獲取更準確的定量結果。
關聯分析：聯合多個組學數據，開展跨組學關聯分析。

技術路線

  • Total RNA
  • 抓取polyA RNA
  • 文庫構建（dUTP鏈特異性
  • 上機測序(HiSeq 4000，PE150)
  • 數據分析

分析內容

    有參考基因組的轉錄組測序：
1. 原始數據產出統計；  2. 與參考基因組比對及統計；
3. 基因和轉錄本表達豐度分析； 4. 轉錄組水平SNP和InDel分析；
5. GO功能分析； 6. KEGG代謝通路分析；
7.基因差異表達譜分析（聚類圖，散點圖，火山圖）； 8. 差異表達基因的GO功能富集性分析，KEGG代謝通路富集性分析；
9.新轉錄本預測； 10.可變剪切分析；
11.DEU（Differential Exon Usage）分析（限生物學重複樣品）。

無參考基因組的轉錄組測序：

1.原始數據產出統計與基本質控處理；
2.轉錄本拼接（根據測序數據獲得轉錄本序列）；
3.Unigene和transcript的長度分佈統計及GC含量統計；
4.根據拼接結果序列進行預測編碼蛋白框（CDS）；
5.Unigene功能注釋（NR、Swissport、KOG、KEGG、Pfam）；
6.Unigene的GO（Gene Ontology）注釋結果；
7.Unigene的KEGG代謝通路注釋；
8.Unigene的KOG注釋結果；
9.轉錄組水平SNV/SNP分析；
10．Unigene的SSR分析（SSR數據信息、SSR分佈統計）；
11.根據RPKM計算標準對基因表達豐度進行分析（表達量數據信息、表達情況統計）；
12.樣本間的基因表達差異分析；
13.差異表達基因的GO功能富集性分析，KEGG代謝途徑富集性分析。


樣本類型

細胞，組織，全血，血清，血漿，總RNA等
建議總RNA起始量：2 μg，最低1 μg，濃度≥50 ng/μL

結果展示

1.差異基因聚類分析熱圖
用於判斷基因在不同實驗條件下調控模式的聚類模式根據樣品基因表達譜的相近程度，將基因進行聚類分析，直觀地展示基因在不同樣品（或是不同處理）中的表達情況，由此獲取生物學相關信息。 
差異顯著差異表達基因上下調頻數統計柱狀圖，用於統計差異基因數目。
 
2.θπ 選擇消除分析圖
圖中橫坐標表示染色體位置，縱坐標反映核苷酸多態性水平。從圖中可以看出，在1 號染色體的不同位置，玉米的 parviglumis 品種（綠線）、地方品種（紅線）和改良品種（藍線）的多態性水平。
 
2.差異表達基因分析火山圖
用於了解差異表達基因的整體分佈情況。以log2(foldchange)為橫坐標，-log10(pvalue)為縱坐標，對差異表達分析中所有的基因繪製火山圖。其中橫坐標代表基因在不同樣本中差異表達倍數變化；縱坐標代表基因表達量變化差異的統計學顯著性。
 
3.差異基因GO富集柱狀圖
用於反映在生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差異基因的個數分佈情況

 
4.GO功能富集散點圖
用於展示GO term的富集情況。Rich factor表示位於該GO的差異基因個數/位於該GO的總基因數，Rich factor越大，GO富集程度越高。

 
5.皮爾森相關係數圖
用於反映生物學重複、樣本相關性，確保後續的差異基因分析得到更可靠的結果。

 
6.可變剪切統計圖
對該物種及其相應的測序樣品進行可變剪切事件的分類及統計。

 
 

常見問題

1.轉錄組測序和DGE的關係是什麼？
轉錄組和DGE主要的差別在於數據量和分析內容上，轉錄組的數據量較大，除了分析差異基因，還可以進行基因結構分析；而DGE就是數字基因表達譜，它的數據量較小，一般只分析差異基因，不能進行基因結構分析。
 
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