近年來RNA上修飾逐漸成為研究的熱點，包括N6甲基腺苷修飾（m6A）、N1甲基腺苷修飾（m1A）、甲基胞嘧啶修飾（m5C）、假尿苷修飾（Ψ）等。作為mRNA中最常見的甲基化修飾，m6A主要富集在mRNA的啟動子區、終止密碼子區附近。作為一種可逆化修飾，RNA既可以在甲基化轉移酶的作用下發生m6A甲基化修飾，又可以在FTO、ALKBH5等酶的作用下發生去甲基化修飾。
已知mRNA 5’ UTR處的甲基化修飾，作用包括維持mRNA穩定性、mRNA前體剪切、多腺苷酸化、mRNA運輸與翻譯起始等。而3’ UTR 發生的修飾有助於出核轉運、翻譯起始，以及與polyA結合蛋白一起維持mRNA的結構穩定。另外RNA甲基化閱讀蛋白還能識別miRNA初級體上的m6A修飾，有助於miRNA成熟體的加工。一旦參與m6A修飾的酶出現異常會引起一系列疾病，包括腫瘤、神經性疾病、胚胎髮育遲緩等。
技術優勢
攜手RNA甲基化研究國際知名團隊，深度優化實驗與分析流程；
提煉數十篇頂級RNA甲基化文章思路，量身定製前沿實驗方案；
提供多組學整合分析與功能驗證一站式服務，大幅縮短實驗周期；
一流的數據挖掘團隊+豐富的論文審稿經驗，加速科研成果發表。
技術路線
分析內容
1.測序序列統計與質控
2.參考基因組比對：參考基因組比對Reads統計、參考基因組比對區域分佈、測序數據比對分佈
3. 全基因組Peak掃描：Peak calling、Peak注釋
4. 差異Peak分析：差異Peak信息統計、差異Peak基因GO富集分析、差異Peak基因KEGG富集性分析
5.Motif分析
樣本要求
組織濕重：推薦800mg起，心肝脾>腦肺腎>骨
細胞樣本：推薦5x107起
總RNA量：total RNA>200ug，mRNA約為10-30ug起
由於物種及樣本類型不一，具體送樣量請諮詢我司技術人員。
用戶文章
1.Alarcón C R, Goodarzi H, Lee H, et al. HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events.[J]. Cell, 2015, 162(6):1299-1308.
2.Alarcón C R, Lee H, Goodarzi H, et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing[J]. Nature, 2015, 519(7544):482.
案例展示
客戶案例1：m6A調控miRNA初級體識別加工
論文標題：N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing
刊登日期：2015年03月
發表雜誌：Nature
影響因子：40.1
研究機構：美國洛克菲勒大學
在miRNA生物合成的第一步是在微處理蛋白複合物的幫助下對初級microRNA（pri-miRNA）進行加工。微處理蛋白複合物由RNA結合蛋白DGCR8和III型核糖核酸酶Drosha組成。這個起始事件需要DGCR8識別pri-miRNA髮夾上莖和側翼單鏈RNA的連接處，並招募Drosha剪切雙鏈RNA產生前體miRNA（pre-miRNA）。pri-miRNA的加工機制已經被闡釋，但是目前並不知道DGCR8在眾多具有二級結構的轉錄本中識別和結合pri-miRNA的機制。
本研究中，洛克菲勒大學Dr.Tavazoie教授發現在哺乳動物細胞中，METTL3會使pri-miRNA發生甲基化，標記的pri-miRNA可以被DGCR8的識別和加工。通過miRNA晶片分析發現，敲低METTL3會降低DGCR8與pri-miRNA的結合作用，引起成熟體miRNA表達量降低，通過未經加工pri-miRNA含量增加。體外實驗證實m6A會促進pri-miRNA的加工。最後，功能驗證實驗揭示METTL3能夠促使miRNA成熟。所以m6A標記是一個關鍵的轉錄後修飾，會促進miRNA生物合成的起始。
客戶案例2：m6A識別酶HNRNPA2B1介導RNA加工
論文標題：HNRNPA2B1 Is a Mediator of m6A-Dependent Nuclear RNA Processing Events
刊登日期：2015年09月
發表雜誌：Cell
影響因子：30.4
研究機構：美國洛克菲勒大學
已知m6A是mRNA中最普遍的一種內部修飾方式之一。各種轉錄本如mRNA、lncRNA等上攜帶的m6A修飾能夠影響RNA在細胞核中的“命運”如RNA降解以及轉錄後加工等。洛克菲勒大學Dr.Tavazoie教授在文中驗證了一種RNA結合蛋白HNRNPA2B1能夠特異性識別轉錄本上的m6A修飾。這些發生m6A修飾的位點所在的motif與甲基化轉移酶METTL3 motif相匹配。此外HNRNPA2B1能夠直接與發生m6A修飾的miRNA初級體（pri-miRNA）相結合，與miRNA微處理蛋白複合物之一DGCR8一起促使pri-miRNA成熟體的加工。
參考文獻
1.Alarcón C R, Goodarzi H, Lee H, et al. HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events.[J]. Cell, 2015, 162(6):1299-1308.
2. Alarcón C R, Lee H, Goodarzi H, et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing[J]. Nature, 2015, 519(7544):482.
結果展示
1.參考基因組比對區域分佈
能夠比對到參考基因組的Valid Data，依照參考基因組的區域信息，可以被定義為比對到exon（外顯子）、intron（內含子）和intergenic（基因間隔區域）。正常情況下，Exon（外顯子）區域的測序序列定位的百分比含量應最高，而比對到intron和intergenic區域的Reads，可能是由於前體mRNA（Pre-mRNA）的剪切事件、基因組注釋不完整以及背景噪音等導致。
2.差異Peak基因GO富集性柱狀圖
GO富集性分析結果柱狀圖反映在生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差異基因的個數分佈情況。
3.差異Peak基因KEGG通路圖
紅色代表注釋到某個ko節點且上調的顯著差異表達基因，藍色或紫色代表注釋到某個ko節點且下調的顯著差異表達基因。方框內的4位數字表示各種酶的EC編號；空心圓圈表示小分子化合物；實心箭頭表示生化反應的方向；虛線箭頭連接其他的相關代謝途徑。本圖僅為展示圖片。
4.Motif分析
RNA甲基化修飾以及去甲基化修飾起始於多種結合蛋白與發生甲基化位點的Motif相結合。Motif本質上是一種具有生物意義的核酸序列模式，這些RNA甲基化相關的酶可識別這些Motif並與之結合，從而影響基因的表達。基因表達調控機制研究是生物學研究的重點內容，鑑定這些motif，對於基因表達調控機制研究具有重要意義。 使用Motif分析軟件MEME在peak區域尋找可信度較高的motif，得到每個Motif的寬度、E-value、PFM、PSSM以及其在各個peak序列總的位置信息等等。
常見問題
1.樣本處理有什麼特殊的要求嗎？
樣本處理方法根據實驗室是否有液氮分為如下兩種情況：
有液氮的情況：
組織樣品離體後，快速用RNase-free配製的生理鹽水/PBS清洗樣本表面的污漬，並吸乾表面的液體，迅速的將樣本分割成長寬高<=0.5cm的小塊（一般重約100mg，不過無需精準測量，一般需要10個小塊左右），將樣本放入已標記好名稱且預冷好的Rnase-free的螺紋管中（不要將蓋子擰死，以免從液氮中取出時破裂），迅速投入液氮中速凍>=1h，然後取出置於-80℃保存，乾冰運輸。
沒有液氮的情況：
提前準備好RNase-free的1.5mL的EP管，向其中加入1mL的RNAfixer。
組織樣品離體後，快速用RNase-free生理鹽水/PBS清洗樣本表面的污漬，並吸乾表面的液體，迅速的將樣本分割成長寬高<=0.5cm，約豌豆大小的小塊（一般重約100mg，不過無需精準測量，一般需要10個小塊左右），然後投入提前準備好的1.5mL的EP管中，使樣本完全浸沒在液體中，然後置於-80℃中保存，乾冰運輸。
注意：實驗操作過程中請務必確保無RNA酶污染。
2.m6A檢測方法有哪些，只能用測序的方法來檢測嗎？
定量方法：LC-MS/MS、EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit（比色法）
高通量測序：m6A-seq（MeRIP-seq）、miCLIP-seq
定量方法只能檢測整體m6A水平，無單鹼基解像度；但是測序方法則沒有此限制。您可以根據實驗的具體需求選擇對應的檢測方法。
