隨着測序技術尤其是高通量測序技術的迅速發展，人們對基因組變異/基因表達差異與表型之間關係的認識越來越深刻。然而傳統的Bulk RNA測序手段是針對細胞集合進行測序，而單個細胞特異性的信息往往被掩蓋，導致錯失很多重要信息。
10X Genomics平台首先利用微流控技術分選單個細胞，然後將帶有barcode和引物的凝膠珠以及單個細胞包裹在油滴中；在油滴中凝膠珠溶解釋放反轉錄oligo，細胞裂解釋放mRNA，通過SMART法獲得用於測序的帶barcode的cDNA；液體油層破壞後，cDNA進行後續文庫構建，使用Illumina測序平台檢測，即可一次性獲得大量單細胞的基因表達數據，10min內自動完成多至80,000個細胞的捕獲，細胞捕獲率最高65%。可實現大量大細胞的快速高效標記、測序和分析，獲得單細胞水平的基因表達譜和差異情況，並通過對複雜細胞群體進行深入細緻分析，繪製大規模單細胞表達圖譜。
樣本類型
超高的細胞通量，利用10X Genomics平台實現真正的單細胞測序。
細胞捕獲效率高，可實現大量大細胞的快速高效標記、測序和分析。
項目周期短，技術應用範圍廣。
技術路線
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組織裂解
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單細胞懸液
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細胞質檢
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單細胞標記
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文庫構建
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上機測序
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數據分析
分析內容
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1. 測序數據質控和定量 |
測序序列統計與質控 |
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數據定量 |
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多樣本數據合併和定量均一化 |
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最終鑑定細胞表達量矩陣 |
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2.細胞亞群分類 |
細胞過濾 |
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單細胞亞群分類 |
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3.Marker基因分析 |
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4.差異基因富集分析 |
差異基因GO富集性分析 |
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差異基因KEGG富集性分析 |
樣本類型
細胞懸液，組織等
代表性文章
Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.
案例展示
Hepatology：單細胞分析顯示肝癌幹細胞的異質性
論文標題：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
發表雜誌：Hepatology
影響因子：14.079
研究機構：美國國家衛生研究院國家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克國家癌症研究實驗室
樣本類型：肝癌細胞系（HuH1和HuH7) ，手術切除腫瘤樣本P1
技術手段：單細胞測序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分選
研究背景:
肝細胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）的腫瘤內分子異質性部分歸因於肝癌幹細胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。 由各種細胞表面標誌物定義的不同CSC群體可能包含不同的致癌驅動因素，這在定義靶向療法時構成了挑戰。 研究人員在單細胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合轉錄組學和功能分析用以評估CSC的異質性程度。結果表明，CSC在單細胞水平上的表型、功能和轉錄均存在異質性性，不同的CSC亞群具有不同的分子特徵。而且有趣的是，不同CSC亞群內的不同基因與HCC預後相關，並且彼此相互獨立，表明CSC異質性影響腫瘤內異質性和腫瘤進展。
文章結果:
大量數據表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面標誌物可以定義CSC，研究人員選擇CD24、CD133、EpCAM分選HuH1和HuH7不同細胞亞群，用於研究CSC生物學和分子水平異質性。免疫熒光染色表明，在兩種細胞培養形態下（單層培養、球體培養）,兩個HCC細胞系均表現出明顯的細胞異質性。
HuH1和HuH7細胞系（原始細胞數分別是1343、1134）正常培養和缺氧培養（促進細胞乾性）2周後，研究人員依照三種表面標誌物（CD24、CD133、EpCAM）分選細胞，HuH1和HuH7中標誌物陽性的CSCs比例分別為15-20%、8-12%，而標誌物陰性CSCs比例只有0-5%（下圖A-B），培養後不同細胞亞群的自我更新能力差異很大（下圖C-D）； 分選後的細胞經過1個月培養後，和未分的得細胞相比，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+細胞能夠擴大成為混合CSCs，而存活下的Triple-細胞能夠擴大成混合CSCs，可能是由於部分細胞不是真正的標記陰性細胞，或者標記陰性細胞經歷了轉換變為標記陽性細胞（下圖E）。
研究人員採用SMART-Seq方式分析HuH1和HuH7陽性標記細胞以及分選的P1（分選CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-細胞）細胞表達譜（單個細胞測序、10細胞混合測序、100細胞混合測序）信息，並與數據庫中人胚胎幹細胞（hESC）、鼠內皮細胞（mEC）和鼠造血幹細胞（mHSC）表達譜數據做了比較，發現不同細胞類群具有不同的基因表達模式，且不同類型細胞中每個細胞的基因表達模式均存在差異，HuH7細胞間差異大於HuH1；當細胞混合（10細胞混合、100細胞混合）後這種差異程度明顯降低（下圖A）。而當單獨聚類HuH7細胞時，發現不同標記細胞彼此可以區分（下圖B）。以上數據均表明單細胞水平上轉錄組存在異質性。
研究人員比較了HuH7陽性標記細胞（Triple+）和陰性標記細胞（Triple-）基因表達差異，鑑定到的286個Triple+相關基因可以預測來自LCI隊列的240例腫瘤樣本、來自TCGA的250例腫瘤樣本的整體生存率，但在非腫瘤樣本中無意義。
不同標記CSC細胞群體基因表達比較分析，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+特徵基因基本不重合（下圖A），IPA通路分析也表明不同細胞群體的通路也不重合（下圖C-F），而且不同細胞群體特徵基因可以用於生存期預測，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有優勢（下圖B）。
為了整體了解細胞群體多樣性，研究人員採用10X 單細胞測序方式，對3847個HuH1、HuH7、P1細胞進行了分析， HuH1可以分為2個亞群，HuH7分為4個細胞亞群，P1分為3個細胞亞群，細胞聚類結果與與SMART-seq結果類似（下圖A）。CSC標誌物，例如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脫氫酶 (ALDH1A1) （下圖B）以及HCC特異基因，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（下圖C）在不同細胞亞群中表達存在異質性。P1的3個細胞亞群中表達了山中因子 (KLF4、POU5F1、MYC)， 幹細胞marker (NANOG)，白細胞marker(PTPRC), T細胞 markers (CD3E, CD8A) 和B細胞marker (CD79A) ，但其表達也存在異質性，其中第一個和第二個P1亞群為HCC浸潤白細胞（分別表達T細胞marker和B細胞marker），第三個P1亞群主要為HCC細胞（下圖D）。
參考文獻
Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
結果展示
1.單細胞亞群分類
針對PCA結果中選取前10個主成分，採用graph-based聚類方法對細胞進行分類。使用相同的數據進行t-SNE分析，然後將聚類結果在t-SNE映射中展示。
2.Marker基因分析
細胞群體Top10 Marker基因的小提琴圖和表達映射圖
3.差異基因KEGG富集性分析
Pathway通路圖展示與說明：紅色代表注釋到某個ko節點且上調的顯著差異表達轉錄本，藍色代表注釋到某個ko節點且下調的顯著差異表達轉錄本，橘黃色代表注釋到某個ko節點不僅有上調又有下調的顯著差異表達轉錄本。方框內的4位數字表示各種酶的EC編號；空心圓圈表示小分子化合物；實心箭頭表示生化反應的方向；虛線箭頭連接其他的相關代謝途徑。下圖僅為報告中的展示圖片
