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　　CRlSPR/Cas9是細菌和古生物菌用來抵抗外來質粒或噬菌體等遺傳物質入侵的一種獲得性免疫系統。利用CRlSPR/Cas9技術建立哺乳動物全基因組突變庫或者與某類功能相關的基因突變體庫，通過功能性篩選和富集以及隨後的PCR擴增和深度測序分析，發掘與篩選表型相關的基因，稱為CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選。gRNA文庫是藥物篩選或靶向篩選特定通路的理想工具，gRNA文庫的建立將在功能基因篩選、疾病機制研究及藥物研發等方面發揮重要的功能。

　　

　　CRlSPR/Cas9 gRNA文庫篩選流程分為五步，即gRNA文庫選擇、gRNA文庫擴增、gRNA文庫慢病毒包裝、gRNA文庫篩選、PCR擴增和NGS測序

　　

　　1、gRNA文庫選擇

　　

　　首先客戶選擇所需gRNA文庫。如果客戶根據具體需要提出文庫定製（小於300個基因），我們將根據客戶提供的基因群信息進行單個基因的gRNA設計，保證每個基因設計3個不同的gRNA，最大程度確保基因功能的突變。我們採用的載體是單/雙慢病毒載體，單慢病毒載體是一個載體上同時攜帶單個gRNA和cas9基因，雙慢病毒載體是一個載體上只有單個gRNA，cas9蛋白則由單獨攜帶cas9的載體提供。這兩種模式載體均攜帶有額外的抗性篩選標記。

　　

　　2、gRNA文庫擴增

　　

　　上述構建的載體數量較少，不足以進行文庫的慢病毒包裝和使用。因此，需要對上述載體進行擴增，增加總量。上述gRNA載體構建完成後，我們將這些載體按相同的比例混合成一個pool（即載體混合庫），隨後將載體混合庫使用專用電轉感受態，電轉擴增培養並收集菌落，並進行擴大培養，最後抽提質粒，即得到了擴增後的載體混合庫，也就是文庫。

　　

　　3、gRNA文庫慢病毒包裝

　　

　　擴增後的gRNA文庫在慢病毒包裝載體的輔助下轉染293T細胞，進行慢病毒的包裝。由於gRNA文庫是由多個不同的gRNA載體混合而成，因此我們獲得的慢病毒是混合型病毒庫，每個病毒攜帶單個gRNA載體。

　　

　　4、gRNA文庫篩選

　　

　　對篩選的目的細胞進行病毒感染預實驗，得到細胞在較低的MOI時感染百分數，以確認感染時gRNA文庫的病毒用量。慢病毒庫以較低的MOI值感染細胞（確保每個細胞最多進入一個慢病毒），隨後根據實驗目的而對細胞採用相應的處理，最後經過不同的篩選方式富集細胞。以耐藥性基因篩選實驗為例，根據前期藥物IC50實驗，得到藥物篩選實驗的處理濃度。採用高濃度藥物處理感染後的細胞，經過篩選後存活的細胞則具有一定的耐藥性，將此群細胞擴增並收集下來，耐藥性的來源是CRlSPR/Cas9 gRNA對相應基因的修飾。

　　

　　5、PCR擴增和NGS測序

　　

　　對步驟4篩選中富集下來的細胞進行慢病毒載體的PCR擴增，該擴增片段包含載體所攜帶的gRNA序列，通過後續的NGS測序，我們可以得到富集細胞中gRNA的富集度，從而尋找到相應的基因，這些基因很有可能參與藥物作用過程，因此可作為深入研究的待選基因。

　　

　　實驗流程如下：

　　gRNA文庫類型：

　　其中定製gRNA文庫，可根據通路中特定基因設計gRNA：

　　

　　1)疾病相關基因：抑癌基因、原癌基因、糖尿病基因、心血管疾病基因、帕金森病基因等；

　　

　　2)信號轉導通路：RAS信號通路、WNT信號通路、JAK-STAT信號通路、NF-kB信號通路、TNF信號通路等；

　　

　　3)細胞功能相關：自噬、細胞周期、細胞凋亡、血管新生、腫瘤抑制等。

　　

　　gRNA文庫篩選表型：

　　

　　1)腫瘤轉移相關基因篩選（體內篩選）

　　

　　2)細胞遷移/侵襲相關基因篩選（體外篩選）

　　

　　3)細胞克隆形成相關基因篩選（體外篩選）

　　

　　4)細胞增殖相關基因篩選（體外篩選）

　　

　　5)腫瘤耐藥相關基因篩選（體外篩選）

　　

　　6)細胞信號通路相關基因篩選（體外篩選）

　　

　　7)其他功能基因篩選，如自噬、細胞分化等

　　

　　gRNA文庫應用領域：

　　

　　1)探索藥物作用機制：藥物靶點確定與驗證

　　

　　2)尋找腫瘤治療靶點：基因環路上下游調控機制分析

　　

　　3)探究代謝疾病治療機制：代謝通路調節機制分析

　　

　　我們的優勢：

　　

　　1)產品全面：不僅擁有人類和小鼠的全基因組gRNA現貨文庫，而且可以定製任何類型的特定文庫，後期更有活性文庫即將推出！

　　

　　2)價格划算：現在訂購gRNA文庫享有一定折扣優惠，讓您的實驗經濟、快速和高效地進行。

　　

　　3)種類多樣：我們不僅可以使用單克隆形式構建sgRNA載體，也可以使用晶片形式合成，確保最大的覆蓋率。

　　

　　4)服務到位：我們除了可以提供gRNA文庫質粒和病毒以外，還可以幫您進行下一步的篩選，最終提供目標基因名稱。

　　

　　我們提供的服務：

　　

　　1)質粒構建：根據客戶需求構建定製的gRNA文庫質粒。

　　

　　2)病毒包裝：將全庫質粒或定製質粒包裝成慢病毒，感染細胞。

　　

　　2)篩選服務：客戶提供篩選方案，可以為客戶提供篩選服務。