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生理操作

成像技術

　　一、鈣離子成像技術（Calcium imaging）　　

　　鈣離子成像技術（Calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監測組織內鈣離子濃度的方法。在神經系統研究中，我們常用鈣離子成像技術監測神經元內鈣離子的變化，提示神經元活動。有了鈣成像技術，原本悄無聲息的電生理活動就變成了一幅形象地、斑斕閃爍的壯觀影像，研究人員可以同時大量追蹤神經元活動，研究其關係，因而被全世界神經科學家們追捧。

　　圖1.鈣離子成像技術　　

　　1）鈣離子成像技術原理　　

　　在生物體內，鈣離子是細胞信號產生的基礎，在很多功能方面有重要作用。在哺乳動物的神經系統中，鈣離子是一類重要的神經元胞內信號分子，神經元靜息狀態下，胞內鈣離子濃度約為50-100nM，而當神經元活動的時候，胞內鈣離子濃度能上升10-100倍，而鈣離子對於突觸囊泡釋放必不可少；神經元在放電的時候會爆發出一個短暫的鈣離子濃度高峰，這意味着神經元鈣離子濃度表徵突觸傳遞和神經元活動。　　

　　圖2 神經元鈣離子濃度表徵突觸傳遞和神經元活動示意圖　　

　　因而，神經元鈣離子成像技術的原理就是藉助鈣離子濃度與神經元活動之間的嚴格對應關係，利用特殊的熒光染料或者蛋白質熒光探針（鈣離子指示劑，Calcium indicator），將神經元中鈣離子的濃度通過熒光強度表現出來，並被顯微鏡捕捉，從而達到監測
神經元活動的目的（圖3）。　　

　　因而，鈣離子成像技術的核心在於鈣離子指示劑，現在廣泛使用的鈣離子指示劑有化學性鈣離子指示劑（chemical indicators）和基因編碼鈣離子指示劑（genetically-encoded indicators）兩類：

　　1、化學性鈣離子指示劑：指的是可以螯合鈣離子的小分子，所有這些小分子都基於BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），BAPTA能夠特異性地和鈣離子螯合，而不會和鎂離子螯合，所以被廣泛地用作鈣離子螯合劑。目前較為成熟的化學性鈣離子指示劑包括Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。　　

　　2、基因編碼鈣離子指示劑：這些指示劑是來自於綠色熒光蛋白（GFP）及其變異體（例如循環排列GFP、YFP、CFP）的熒光蛋白質，與鈣調蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域融合。現在使用較廣泛的基因編碼鈣離子指示劑有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，其中GCaMP6由於它有着超強的敏感度，現在被廣泛應用於活體鈣成像研究，其發出熒光的原理在於鈣離子濃度上升導致M13與CaM結合，從而改變cpEGFP的構象，將其從無熒光的狀態變為綠色熒光

　　圖3 GCaMP蛋白的基本結構和原理（來自WIKI）　　

　　2）常見的鈣離子指示劑　　

　　1、GCaMP6系列：　　

　　第六代GCaMP蛋白（GCaMP6）有三種不同亞型：GCaMP6s、GCaMP6m、GCaMP6f，其特點各不相同（圖4）。GCaMP6s高敏感，適合低頻信號的指示，；GCaMP6f有快速動力學曲線，解離最快，適合高頻信號的指示，需要根據實驗需求進行選擇。

圖4 幾種不同GCaMP蛋白的特性（Douglas S. Kim, et al., Nature, 2013）　　

　　2、jGCaMP7家族：　　

　　jGCaMP7（Janelia GCaMP7，區別於過去出現過的G-CaMP7）。包括四類不同特點的蛋白：jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7b、jGCaMP7c（圖5）。jGCaMP7s高敏感；jGCaMP7f具有快速動力學曲線，適用於更強的檢測單動作電位反應或群里活動實驗；jGCaMP7b具有較明亮的背景熒光，適用檢測神經元突起或神經纖維；jGCaMP7c的本底熒光最低，對比度高，信號清晰，適用於大範圍成像。　　

圖5 jGCaMP7蛋白的反應特點（Douglas S. Kim, et al., bioRXiv, 2018）　　

　　3、XCaMP系列：　　

　　基於CaMKK為骨架，通過一系列的突變篩選，包括四種不同顏色：藍色的XCaMP-B，綠色的XCaMP-G，橙色的XCaMP-O和紅色的XCaMP-R（圖6）。其中XCaMP-G的熒光強度比GCaMP6強，動作電位刺激誘發的鈣離子反應性能也比GCaMP6有明顯提高。結合特定的神經元特異的表達方法，可實現在自由活動狀態下同時監測特定行為中三種不同神經元類型的活動；結合雙光子顯微鏡，進行微結構功能成像，實現對突觸前和突觸後結構同時雙色成像。

　　圖6 XCaMP蛋白特點（Haruhiko Bito’s, lab.,cell, 2019）　　

　　4、CaMPARI：　　

　　一種能夠兼顧全局和微觀的新型鈣成像技術，包含CaMPARI以及CaMPARI2（第二代）。其原理在於，CaMPARI蛋白在正常狀態下會發出綠色熒光，而如果對這種蛋白同時使用高濃度鈣離子與紫外光處理，它就會不可逆、永久地轉變成另一種能發出紅色熒光的構象，即實現將瞬間的神經元活動變成永久的紅色熒光蛋白表達（圖7）。研究人員通過轉基因技術將這種新型蛋白導入到實驗動物的神經系統中，然後用高強度的紫外光照射動物的大腦，通過檢查熒光，找到發紅色熒光的神經元，這些神經元即是在紫外光照射期間活躍的神經元。由於紫外光可以對着整個大腦進行照射，所以理論上，人們可以對全腦進行檢查。

　　圖7 CaMPARI技術原理（Eric R. Schreiter, et al., Science, 2015）　　

　　5、jRGECO1a&RCaMP：　　

　　紅色的鈣離子敏感蛋白，可以同GCaMP一起使用，標記同一小鼠同一腦區兩類細胞的活動不同的神經元類型。　　

　　6、GCaMP-X：　　

　　無損傷鈣離子探針，可保護依賴於L型鈣通道的興奮-轉錄耦合免受干擾，同時仍表現出部分GCaMP的優良Ca2+感應特性。　　

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　　二、電壓成像（voltage imaging）　　

　　細胞內鈣離子濃度變化和細胞膜電位的變化是細胞活動的兩個重要指標，由於鈣信號衰減較慢，並不能充分表徵神經元的動作電位，而且閾值以下的電壓信號完全被忽略，於是科學家們利用細胞膜電位改變作為信號進行熒光成像。

　　1)電壓成像技術原理　　

　　細胞膜電位變化是細胞活動最基本的信號，當膜電位變化時，細胞膜上鑲嵌的許多蛋白質分子都會改變形狀，這類隨膜電位改變形狀的蛋白分子叫電壓敏感元件。而電壓成像技術原理就在於將電壓敏感元件和熒光蛋白連接起來，當膜電位改變時，電壓敏感蛋白的改變就會影響熒光蛋白的結構，從而改變了後者的發光特性。這樣就可以利用熒光來看神經細胞膜的膜電位變化了。　　

　　遺傳編碼的熒光電壓指示劑（Genetically encoded voltage indicators, GEVIs）改造於一種細菌能吸收陽光的蛋白質--古紫質Archaerhodopsin，其能隨着細胞膜電位改變發出熒光。通過GEVIs我們可以成像神經元的快速放電信號與閾下電活動，能實時監測細胞膜電位的波動，相比於鈣指標，更能直接反映神經元的活性。

　　圖8 三種類型GEVIs的示意圖（Storace, D., et al., Trends Neurosci, 2016）　　

　　Voltron，是一種新型電壓指示劑，不同於傳統的GEVIs依賴於微生物視紫紅質或熒光蛋白（這些熒光基團缺乏亮度與光穩定性），Voltron利用明亮且耐光型的合成染料。其原理在於Voltron將電壓敏感性微生物視紫紅質結構域和自標記蛋白標記域結合染料結合，後者可共價結合一種人工熒光染料配體，合成染料給藥方式簡單，且可跨血腦屏障。體內同時成像神經元的數量擴大10倍，且成像時間更加持久。

　　圖9 Voltron結構的示意圖（Eric R. Schreiter’s lab., science, 2019）　　

　　神經元功能成像是探究神經元編碼各種功能的重要科學手段，廣泛應用於神經生物學等各個研究領域，目前最常用方法為鈣成像和電壓成像。得益於雙光子成像技術，通過記錄細胞內鈣離子濃度變化或細胞電位變化，實時反應細胞活動，實現了一系列行為動物活體動態功能成像技術！　　

　　三、神經遞質熒光探針　　

　　在已知宇宙中，腦可能是最複雜的物體之一。根據前人的估計，我們的腦大約有1010-1012個神經元和1011-1013個膠質細胞，同時每個神經元擁有103-104個突觸與其他神經元形成聯繫。神經遞質作為突觸間傳遞信息的重要“信使”，在神經元與細胞之間的通訊交流中起到關鍵的媒介作用，神經遞質的紊亂常常伴隨各種疾病的發生。因此,對神經遞質的探測追蹤是研究大腦功能和相關疾病的重要環節。然而，如何在擁有數十億個神經細胞、數萬億個突觸連接的大腦中精確檢測神經遞質的釋放，是長久以來困擾科學家的一個難題。　　

　　北京大學李毓龍團隊利用可與神經遞質相結合的G蛋白偶聯受體作為探針的骨架，將熒光蛋白（cpEGFP）與特異性的人源神經遞質受體巧妙地進行分子水平的融合和改造，成功開發出新型可遺傳編碼的一系列神經遞質熒光探針。　　

　　1）神經遞質熒光探針原理　　

　　這一系列神經遞質探針原理類似，都是基於人源神經遞質受體，其原理在於把cpEGFP嵌入特定的神經遞質受體，受體與神經遞質結合後會引發受體構象改變轉換為熒光信號（圖10）。　　

　　目前通過病毒注射、轉染等技術手段，可以將這種可遺傳編碼的探針表達在細胞或小鼠腦部，藉助成像技術，觀察神經遞質濃度的實時變化。這類神經調質探針具有極高的靈敏度、分子特異性、精確的空間解像度和亞秒級響應速度，已在果蠅、斑馬魚。小鼠腦部十幾種神經元上得到驗證，這將為研究大腦的功能以及神經系統疾病機制的解析提供重要的工具。

　　圖10 GACh原理（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）

　　2)常見的神經遞質熒光探針　　

　　1、DA　　

　　多巴胺是大腦中一種重要的神經遞質，調控包括學習、記憶、運動等一系列關鍵功能，多巴胺失調會導致精神疾病或神經退行性疾病，多巴胺探針包含：DA1h和DA1m兩種版本，分別對應高/低親和力，適用於多巴胺釋放量不同的腦區（圖11）。

　　圖11 GRABDA sensors表達在細胞和神經元中（Yulong Li’s lab., cell, 2018）　　

　　2、Ach　　

　　乙酰膽鹼是人類發現的第一種神經遞質，負責調節睡眠、成癮、學習記憶等過程。乙酰膽鹼信號傳遞失常，會導致先天性肌肉萎縮、糖尿病、阿茲海默症等疾病。GACh2.0對生理濃度乙酰膽鹼具有高信噪比、高靈敏性的光學信號變化響應，並且具有亞秒級動力學及高度分子特異性，可實現對時空特異性乙酰膽鹼信號的精確指徵（圖12）。

　　圖12 GACh2.0 sensors特性（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）　　

　　3、NE　　

　　去甲腎上腺素作為一種重要的單胺類神經遞質，參與感覺信號的調節、注意力調控、睡眠於覺醒、學習記憶等生理過程，去甲腎上腺素釋放或信號傳遞的受損與一系列的精神疾病和神經退行性病變息息相關。去甲腎上腺素探針包含：NE1m和NE1h兩種版本，分別對應高/低親和力，適用於檢測局部突觸傳遞和非局部非突觸傳遞的去甲腎上腺素釋放（圖13）。