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疾病研究（心、肝、肺）

疾病研究（心、肝、肺）

疾病研究（心、肝、肺）

　　基於對病毒載體的深入了解和研發，越來越多的科研人員開始藉助病毒載體進行疾病研究。目前，病毒載體工具在不同組織器官中均有大量的應用，通過使用工具病毒載體，對疾病相關基因進行定向和組織特異性的改造和操控，已成為科研人員進行疾病研究與治療的一種技術手段。

　　病毒載體的選擇

　　不同病毒載體的大小迥異，意味着其內含基因容量存在巨大差異；免疫原性的不同，意味着其體內/體外應用的場景需要細微調整；表達時間和周期的不同，意味着我們需要根據研究需求進行相對應的選擇。

表1 不同病毒的生物學特性比較

	慢病毒	腺相關病毒	腺病毒	逆轉錄病毒
包膜	有	無	有	有
顆粒直徑	80-100 nm	20-30 nm	90-100nm	~100nm
基因組	dsRNA	ssDNA	dsDNA	RNA
基因組大小	9.75kb	4.7kb	36kb	~5kb
表達起始時間	48-72h	72-96h	24-48h	48-72h
表達持續時間	> 2 months	> 6 months	< 1 month	> 2 months
體內擴散能力	一般	強	強	一般
免疫原性	中等	極低	強	中等
滴度範圍	10⁸~10⁹TU/mL	10¹²-10¹³VG/mL	10¹¹-10¹²PFU/mL	10⁷~10⁸TU/mL
滴度檢測方法	qPCR整合DNA	qPCR非整合DNA	抗原抗體免疫染色試劑盒	qPCR整合DNA
整合方式	隨機高頻整合	定向低頻整合（rAAV不整合）	非整合	隨機整合
應用範圍	體外細胞感染，gRNA文庫篩選，體內	基於不同的血清型，體內廣泛應用	嗜肝，快速表達或短期表達，血液、心臟，細胞系等	特異性只感染分裂期的細胞

　　重組腺相關病毒載體（rAAV），一直是體內研究的明星載體，除了其免疫原性極低、安全性高、宿主細胞範圍廣、擴散能力強、體內表達基因時間長等優勢外，還在於其種類多樣性。

　　現在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結合產生的混合體病毒載體，一般標記為rAAV2/N (N為不同的衣殼血清型)。重組的病毒具有AAV2型的穩定表達和基因整合能力，同時獲得了不同血清型的組織感染嗜親性，表現出一定的器官靶向特異性。

表2 不同血清型AAV的組織嗜親性

血清型	組織親和性
rAAV2/1	神經系統（高滴度順向跨突觸），肌肉，骨骼肌，心肌，平滑肌
rAAV2/2	神經系統，肌肉，肝臟，血管平滑肌，眼
rAAV2/3	肌肉，肝臟，肺，眼
rAAV2/4	神經系統，肌肉，眼，腦
rAAV2/5	神經系統，肺，視網膜，肝臟，滑膜關節
rAAV2/6	神經系統，肺，肌肉，心臟
rAAV2/7	肌肉，肝臟
rAAV2/8	神經系統，肝臟，胰腺，視網膜，脂肪組織
rAAV2/9	神經系統，心肌，肺，視網膜，皮膚，肌肉，脂肪組織
rAAV2-retro	神經系統（逆向非跨突觸）
AAV-PHP.eB	跨血腦屏障（靜脈注射）
AAV-PHP.S	全外周神經（尾靜脈注射）
AAV-PAN	胰腺（腹腔注射）
AAV-LUNG	肺（尾靜脈注射）
AAV-DJ	視網膜，肺，腎臟，體外感染細胞
AAV-7m8	視網膜
AAV-ShH10Y	視網膜Muller細胞
AAV-Rh10	肝臟，血液，心臟，體外感染細胞
AAV-Anc80L65	內耳、視網膜、骨骼肌、肝臟
AAV-SCH9	SVZ區神經幹細胞

　　小建議：如您不確定選擇哪種血清型，可嘗試使用尊龙凯时Pandora’s Virus （AAV試用裝）進行預實驗，通過比較不同血清型對目標組織的感染效果，摸索最佳實驗條件（注射方法、注射位點、病毒用量等），以便得到更理想的實驗結果。（連結到Pandora’s Virus＞＞）

肝臟

　　肝臟是調控機體脂質代謝、血糖代謝的重要器官，其功能異常會導致脂肪肝、高膽固醇血症、高血脂症、糖尿病等疾病。

　　1、注射方式

　　應用病毒載體感染肝臟一般採用尾靜脈注射的方式。

　　按照尊龙凯时多年的經驗，使用AAV載體感染肝臟組織一般選取AAV2/8血清型，通過尾靜脈注射手段感染肝臟每隻小鼠需要注射1x10¹⁰總滴度的病毒載體。

　　尊龙凯时AAV感染結果

　　2、應用案例

　　2.1 肝臟特異啟動子TGB

　　客戶發表文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶體，腺相關病毒過表達]

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　　注射方式：小鼠尾靜脈注射

　　載體：AAV8-TGB-Fabp1

　　血清型：rAAV2/8

　　注射量：200ul，2× 10¹¹ VG

　　觀察時間：1周

　　2.2 Cre-loxp技術在小鼠肝臟中的應用

　　由於腺病毒高度嗜肝，幾乎90%以上會感染肝臟，因此腺病毒可以作為肝臟特異性感染的有效載體。將Cre腺病毒（Ad-Cre）通過尾靜脈注射入帶有loxp小鼠體內，即可實現肝臟特異性表達並將目的基因敲除，從而快速獲取肝臟特異性基因敲除小鼠。

　　2.3 CRISPR/Cas9技術在小鼠肝臟中的應用

　　通過腺病毒將CRISPR/Cas9系統相關元件（Cas9和sgRNA）注射入小鼠體內，可以實現在肝臟中特異性表達，並實現肝臟部位的特異性敲除。此方法比較適合檢驗活體實驗。

胰腺

　　胰腺是一個兼有內、外分泌功能的器官，與機體消化、血糖代謝、脂質代謝等有密切的關係，也是代謝研究的關鍵目標器官之一。

　　在實際研究中，使用病毒載體感染胰腺主要有兩種方式，一種是使用AAV2/8病毒載體，通過膽管將病毒注射入胰腺；另一種新方法是使用尊龙凯时新研發的AAV-PAN病毒載體，腹腔注射感染胰腺：

尊龙凯时AAV-PAN感染結果

心臟

　　1、注射方式

　　AAV的注射方式，不同的文章中採用了不一樣的注射方式。總體上，一般包括靜脈注射、心腔內注射、心肌內定點注射、心包內注射（介於心肌與心包膜之間），其中靜脈注射包括尾靜脈注射、頸靜脈注射、面部靜脈注射等。

　　尾靜脈注射和心腔內注射由於病毒流進血液循環，分佈較均勻。心腔內注射需要結合主動脈嵌夾進行，由於開胸腔手術需要輔助呼吸，對手術操作要求較高。心肌內定點注射時每點注射2-5ul，效果是在注射的局部點附近表達較高，但擴散非常有限。總的來說，很多實驗直接用尾靜脈注射即可，但是可能需要較高劑量的病毒，如果用心肌內定點注射，即小量多點注射，可以達到很好的感染表達效果，但是後者操作技術難度略高，也需要花費更長的操作時間。

　　結合新生鼠（出生2-10天）注射效果比較來看，新生鼠注射表達效果大大優於成年鼠，消耗病毒劑量也相對較低。新生鼠的注射，一般根據實驗室的條件來看，可以選擇頸靜脈注射、面部靜脈注射和心腔內（左心室）注射，目的是將病毒導入血液循環中。

　　2、啟動子選擇

　　一些常用啟動子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用於驅動在心臟組織中的表達。很多高效的啟動子由於片段較大，如αMHC，僅用於轉基因小鼠等實驗，不適合裝載在AAV載體上。通過查閱文獻，我們發現一些小的啟動子如CMV在心臟組織的表達能力比較強，特別對於大片段的驅動效果很明顯，但是如果需要介導的目的基因在心臟中特異性表達，則推薦使用cTnT啟動子，cTnT常被用於心肌的特異性表達，表達能力也很強。

　　3、應用案例

　　3.1 心臟特異性啟動子cTNT

　　客戶發表文章：Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.

　　注射方式：

　　載體：AAV9

　　血清型：rAAV2/9

　　啟動子：cTnT

　　注射量：200ul，2× 10^{11^VG}

　　觀察時間：1周

　　3.2 Cas9心臟特異性轉基因小鼠

　　科學家構建了帶有eSpCas9（1.1）的心臟特異性轉基因小鼠，通過Myh6基因的啟動子（αMHC）驅動Cas9在心肌的特異性表達。αMHC啟動子是心臟特異性轉基因小鼠常用啟動子。這個工具小鼠能夠解決實驗過程中Cas9在心臟遞送和表達的難題。轉基因小鼠可以維持Cas9在心臟長期高水平的表達，而這個正是CRISPR/Cas9系統在心臟部位編輯效率不高的癥結所在。

　　Cas9轉基因小鼠，只需要通過AAV遞送sgRNA到心臟表達即可實現，這種方法可以獲得比較高的編輯效率。研究人員將靶向Myh6基因外顯子sgRNA通過裝載在AAV載體上注射入小鼠，實現心臟特異性敲除。Myh6表達水平降低50%以上，同時成功得到發生心肌肥厚和擴張型心臟的突變小鼠。

肺部

　　目前對於肺部的病毒感染，普遍採用AAV病毒載體，使用病毒載體感染胰腺主要有兩種方式，一種是使用AAV2/9病毒載體，通過鼻內或氣管內遞送（經呼吸道）將病毒通過肺呼吸道遞送，參考劑量是1×10¹¹VG病毒，體積50ul；另一種新方法是使用尊龙凯时新研發的AAV-LUNG病毒載體，尾靜脈注射特異性感染肺部：

　　尊龙凯时AAV-LUNG感染肺部結果

肌肉

　　目前，對於肌肉組織中使用的病毒載體通常會選用AAV病毒載體，因為AAV不僅能夠高效特異地靶向肌肉組織，且能在肌肉組織中表達持久。腺病毒使用時容易引起較強的免疫反應，並且很容易被清除，表達時間比較短暫，較少被應用於肌肉組織的靶向表達。儘管慢病毒感染表達範圍廣泛，對培養的肌肉細胞均能高效表達，但是對肌肉組織的感染表達非常有限。目前靶向肌肉的AAV載體血清型主要為AAV1，AAV6和AAV9。其中，AAV9的表達效率最高，並且更容易在肌肉中高表達。

　　1、注射方式

　　應用病毒載體感染肌肉組織進行研究，一般分為系統注射和肌肉內注射，系統注射表達較均勻，但是大部分病毒會被其他臟器組織吸收，導致靶向肌肉的病毒較少。肌肉內注射是一種定點注射，可以在注射點附近高效表達，但缺點是病毒擴散十分有限，因此往往需要多點注射，一般每個點在5-10ul。

　　2、應用案例