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環路示蹤

環路示蹤

環路示蹤

　　神經元之間的環路連接非常複雜，完整而準確地顯示這些環路的結構和變化，對揭示許多疾病的病因和新治療方法的開發具有非常重要的意義。

　　傳統的神經示蹤方法如電鏡、Golgi染色、染料、肽類標記物等可以顯示神經元的形態和投射，少數示蹤劑如WGA、TTC等還可以實現跨突觸標記，但這些方法都具有信號間接、方向不特異、跨突觸後信號衰減嚴重等缺點，最重要的是，這些染料無法攜帶基因，因此只能顯色。自20世紀80年代，Kristensson首次應用單純皰疹病毒（HSV）跨突觸標記神經元後，各種各樣病毒載體在環路示蹤方面的應用越來越受到重視。

　　但需要注意的是，雖然這類嗜神經病毒對於神經環路的標記具有很強的感染性和特異性，但其免疫原性很強，動物往往在注射後數天死亡，無法進行行為測試或者生理研究，目前更適用於尋找未知的神經環路，此外此類病毒需要PII以上等級的實驗室。因此，越來越多的研究使用AAV進行環路示蹤標記。由於AAV本身無複製能力，且其免疫原性極低，因而其不會造成大量的毒害，亦不會影響動物的正常生理，故AAV成為最常用的環路示蹤工具病毒載體。

　　神經元是具有極性的細胞，信息從上一級神經元的軸突通過突觸傳遞到下一級神經元的樹突，之後發生樹突、胞體的信息整合，並通過軸突再次發出。因此涉及神經環路的標記包括方向性（順向：胞體至軸突的標記；逆向：軸突至胞體的標記）和是否跨突觸兩大基本問題（圖1）。

　　圖1 神經環路示蹤技術的目標（改自Peter L Strick, et al., eLS, 2011）

　　環路示蹤應用案例

　　1、基於AAV的順向非跨突觸標記

　　① 客戶發表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相關病毒, 癢, 光遺傳,化學遺傳]

　　注射部位：小鼠PBN

　　載體：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine

　　血清型：AAV2/9

　　病毒滴度：1.0× 1013 VG/mL

　　注射體積：150nl

　　觀察時間：3周

　　② 客戶發表文章：Neuron. (IF=14.319). Tian-Le Xu,et.al. (2019). Central Processing of Itch in the Midbrain Reward Center. [AAV，癢，光遺傳學]

　　注射部位：Vgat- Cre小鼠VTA

　　載體：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry

　　血清型：AAV2/8

　　病毒滴度：7.39×1012 VG/mL

　　注射體積：300-400nl

　　觀察時間：2-3周

　　2、基於AAV的逆向非跨突觸標記—rAAV2-retro

　　① 客戶發表文章：Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相關病毒, 焦慮症, 光遺傳]

　　注射部位：小鼠dmPFC、VHPC

　　載體：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry

　　注射體積：300nl

　　觀察時間：4周

　　② 內部測試結果

　　注射部位：小鼠BPN

　　載體：rAAV2-retro-hSyn-EYFP

　　觀察時間：4周

　　3、基於AAV的跨突觸標記

　　3.1 基於AAV的順向跨突觸標記-- rAAV2/1

　　① 客戶發表文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相關病毒, 神經環路]

　　注射部位：小鼠皮層M1、PMC

　　載體：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s

　　病毒滴度：rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2 × 1013 VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5 × 1012 VG/mL

　　注射體積：多點注射，每位點30-40nl

　　觀察時間：4周

　　② 客戶發表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相關病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]

　　注射部位：小鼠皮層BLA

　　載體：rAAV2/1-hSyn-Cre-EGFP

　　病毒滴度： 1.13 × 1013 VG/mL

　　注射體積：60nl

　　觀察時間：5周

　　3.2 藉助WGA的跨突觸標記—AAV-WGA-Cre

　　客戶發表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相關病毒, 成癮, AAV1, AAV-WGA-Cre]