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慢病毒

慢病毒載體

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慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經被剔除並被外源性目的基因所取代，屬於假型病毒可將外源基因整合到基因組中實現穩定表達，具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。
　　
　　慢病毒基因組進入細胞後，在細胞漿中反轉錄為DNA，形成DNA整合前複合體，進入細胞核後，DNA整合到細胞基因組中。整合後的DNA轉錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白或產生小RNA。慢病毒介導的基因表達或小RNA干擾作用持續且穩定，並隨細胞基因組的分裂而分裂（圖1）。

　　圖1 慢病毒包裝和侵染細胞的過程
　　
　　慢病毒載體具有宿主範圍廣，免疫原性低，基因容量大，可以長期表達等特點。能夠有效地感染培養的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經元、內皮細胞、幹細胞等多種類型的細胞。
　　
　　慢病毒的感染具有整合特性，能夠將外源基因有效地整合到宿主染色體上，達到持久性表達，因而可構建穩定細胞株，用於基因的細胞功能研究。藉助慢病毒載體改造T細胞可用於CAR-T細胞治療。



慢病毒包裝與純化

　　慢病毒包裝採用三質粒或四質粒系統進行包裝，收集細胞培養上清，通過超速離心濃縮純化和收集病毒。


慢病毒滴度檢測

　　檢測方法：定量PCR檢測感染後細胞基因組中外源DNA拷貝數
　　
　　實驗原理：慢病毒介導外源基因以逆轉錄方式整合進目的細胞基因組


慢病毒載體優勢

① 表達時間長：慢病毒可將外源基因整合到宿主細胞基因組上，實現基因長時間穩定的表達，不隨細胞分裂傳代而丟失，是細胞實驗的首選，常用於構建穩定株。
② 安全性高：未發現致病性，慢病毒載體改造T細胞用於CAR-T細胞治療。
③ 免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用於動物實驗。
不同病毒的生物學特性比較
載體選擇
　　尊龙凯时擁有豐富的慢病毒產品，用於操作編碼基因和非編碼基因，如lncRNA、microRNA、circRNA，如下慢病毒載體可供您選擇（不限於此列表）：
調控方式 載體編號 載體名稱（載體元件順序） 真核抗性 熒光 啟動子 默認標籤 載體容量
   過表達 GL127 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE N/A EGFP CMV 3FLAG 4.8kb
GL121 pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE N/A EGFP CMV N/A 4.4kb
GL129 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE N/A mCherry CMV 3FLAG 4.8kb
GL119 pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG 4.4kb
GL120 pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.5kb
GL107 pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A 3.8kb
GL122 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A 3.9kb
GL130 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb
GL132 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro EGFP CMV N/A 3.7kb
GL123 pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
GL125 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb
GL133 pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro mCherry CMV N/A 3.7kb
H114 pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.2kb
GL124 pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.8kb
 表達cre H126 pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 3.9kb
H15108 pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 5.3kb
三標 H7656 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE Puro mNeonGreen CBh 3FLAG 1.3kb
H7657 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE Puro tdTomato CBh 3FLAG 0.6kb
H9911 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE blasticidin mNeonGreen CBh 3FLAG 1.5kb
H9912 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE blasticidin tdTomato CBh 3FLAG 0.8kb
circRNA過表達 H8384 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE N/A EGFP CMV N/A 3.0kb
H8807 pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 4.8kb
H8399 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE Puro EGFP CMV N/A 1.0kb
H8810 pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 2.8kb
miRNA過表達 GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
H3919 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
H119 pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE Puro TurboGFP CMV N/A N/A
H3928 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
H146 pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG N/A
H7505 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A N/A
H7506 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A
過表達（Tet-on） H125 pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro EGFP TRE N/A 2.0kb
H121 pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP TRE 3FLAG 3.3kb
H2057 pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro N/A EF1 N/A N/A
shRNA干擾 GL401 pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
GL404 pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U6 N/A N/A
GL427 pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A
GL428 pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A
H7615 pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE blasticidin mCherry U7 N/A N/A
CRISPR敲除 H5070 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A
H7072 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
H6825 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE N/A sfGFP U6 N/A N/A
H5068 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U7 N/A N/A
H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG N/A
CRISPRa轉錄激活 H9517 pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A
E2577 pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE hygromycin N/A EF1a N/A N/A
H7284 pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-MCP-P65-HSF1-IRES-BSR-WPRE blasticidin N/A U6/CMV N/A N/A
H7281 pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A N/A


常規應用

　　體外感染細胞
　　
　　慢病毒載體能夠有效地感染培養的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經元、內皮細胞、幹細胞等多種類型原代細胞和大部分細胞系。
　　
　　慢病毒的感染具有整合特性，能夠將外源基因有效地整合到宿主染色體上，因而可以達到持久性表達，從而構建穩轉細胞株，體外進行細胞功能學實驗，包括細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等研究。穩定表達目的基因的腫瘤細胞株還可以進一步構建腫瘤動物模型，進行體內基因功能驗證，藥效藥代，活體成像等檢測，進一步研究體內腫瘤發生、發展和轉移及藥物治療的效果。
 


　　常見MOI列表
細胞名 中文名稱 慢病毒感染MOI
（參考值）
MGC80-3 人胃癌細胞 10
HT-29 人結腸癌細胞 20
RKO 人結腸腺癌細胞 10
Caki-1 人腎透明細胞癌皮膚轉移細胞 10
5637 人膀胱癌細胞 10
U-118 MG 人腦星形膠質母細胞瘤 10
RWPE-1 人正常前列腺上皮細胞 20
HeLa 人宮頸癌細胞 10~20
Ca Ski 人宮頸癌腸轉移細胞 10
MCF7 [MCF-7] 人乳腺癌細胞 10
A549 人非小細胞肺癌細胞 10
NCI-H1299 人非小細胞肺癌細胞 20
U-87 MG 人腦星形膠質母細胞瘤 10
U251 人膠質瘤細胞 10
A172 人膠質母細胞瘤細胞 10
K-562 人慢性髓原白血病細胞 10
HL-60 人原髓細胞白血病細胞 10
GES-1 人胃上皮細胞 20
U266 人骨髓瘤細胞 20
CAL 27 人舌鱗癌細胞 20
PC9 人肺癌細胞 5
PC14 人肺癌細胞 10
MADB-106 大鼠乳腺癌細胞 20
F98 大鼠腦膠質瘤細胞 20
MHCC-97H 人肝癌細胞（高轉移） 10~20

　
　　MOI 是multiplicity of infection 的縮寫，即感染複數，其含義是感染時病毒與細胞的數量比值，一般以實驗中某個細胞，感染達到80%，定義為這個細胞的MOI值，即病毒量與細胞數的比值；加的病毒量(μl)=細胞數×MOI/滴度(…/ml) ×1000


慢病毒在腫瘤研究中的應用案例
 
1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 膠質細胞瘤]
慢病毒干擾： Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1
2. Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
慢病毒過表達/干擾：pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro
 
慢病毒在神經系統的應用（在體注射）
1．Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 學習與記憶]
病毒類型：慢病毒
載體名稱：LV-Suv39h1-RNAi（不確定詳細的）
注射部位：海馬DG區
病毒注射量：2 μL，9.98 × 108 TU/mL
檢測時間：2周
 
2．Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神經環路]
病毒類型：慢病毒
載體名稱：LV- CX36-shRNA-EGFP（不確定詳細的）
注射部位：P1小鼠新皮層L1
病毒注射量：1μL
檢測時間：2周
3．Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自閉症]
 
病毒類型：慢病毒
載體名稱：Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位：小鼠海馬CA1區
病毒注射量：1μL
檢測時間：4周
 
慢病毒延伸服務
 
尊龙凯时慢病毒的生產和質控採取了國際學術界公認的標準流程，採用三質粒或四質粒系統在293T細胞中進行包裝。所獲得的病毒顆粒經過超速離心純化，並通過qPCR對病毒基因拷貝進行滴定。一般情況下我們的慢病毒的滴度在108~109TU/ml，完全可以滿足各類實驗的使用要求。
諮詢服務熱線：021-58585887   聯繫人：姜女士    聯繫電話：13501676670 聯繫郵箱：jxl@kohagroup.com
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